黄曲霉**B1试剂盒

黄曲霉**B1试剂盒

【产品简介】

黄曲霉**是一类**（如黄曲霉和寄生曲霉）的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性，主要存在于谷物、坚果、棉籽以及一些和人类血液，动物饲料相关的产品中。其中黄曲霉**B1（AFB1）的毒性、致癌性、污染频率均居于首位。薄层色谱一直是检测黄曲霉**常用的方法，但是此方法制备样品及分析样品时费时又费力。而使用黄曲霉**B1 ELISA试剂盒则能够快速而准确的分析样品中黄曲霉**B1残留。参考国家标准GB/T 5009.22-2003。

黄曲霉**B1试剂盒【测定原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物黄曲霉**B1和微孔条上预包被的偶联抗原竞争黄曲霉**B1抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物黄曲霉**B1的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应残留物黄曲霉**B1的含量。

【试剂盒技术指标】  

规       格：96孔/盒

灵 敏 度： 0.025ppb

检测时间： 75min

样本检测下限：

大米、玉米、小米………………………………2.5ppb

酱油、醋…………………………………………0.5ppb

食用油……………………………………………2.5ppb

酒类（葡萄酒、啤酒、黄酒）…………………0.5ppb

花    生……………………………………………2.5ppb

月饼、桃酥、花生酱等……………………………1ppb

面    粉………………………………………………1ppb

一般饲料…………………………………………2.5ppb

饲料（配合料及浓缩料）…………………………1ppb

牛奶………………………………………………0.5ppb

反应率：

黄曲霉**B1……………………………………100%

回收率：

食    品…………………………………………85±10%

饲    料…………………………………………75±10%

黄曲霉**B1试剂盒【试剂盒组成】  

1、     微量测试孔：（1X96孔板）每条8孔，一板12条

1、     标准液X6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.025ppb、0.05ppb、0.1ppb、0.2ppb、0.4ppb

2、     酶标记物       12ml…………………………红色帽

3、     抗体工作液     7ml…………………………绿色帽

4、     底物液 A液    7ml…………………………棕色帽

5、     底物液 B液    7ml…………………………黑色帽

6、     终 止 液          7ml…………………………黄色帽

7、     20X浓缩洗涤液40ml…………………… 透明帽

8、     5X浓缩样品稀释液50 ml…………………蓝色帽

【所用仪器、试剂】  

仪          器：微孔板酶标仪450nm/630nm、旋转蒸发仪/氮气吹干装置、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量

                   0.01g）

微量移液器：单道 20μl～200μl、100μl～1000μl、多道 250μl

试           剂：甲醇、三氯甲烷、正己烷、滤纸

黄曲霉**B1试剂盒【样本前处理步骤】  

处理任何样本时，都必须注意：

（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

样本前处理需配制：

配液1、50%甲醇溶液：50ml蒸馏水或去离子水和50ml纯甲醇混合制备50％甲醇溶液。

配液2、将5X浓缩样品液用去离子水按照1：4稀释（1份浓缩样品液+4份去离子水）用于样品的稀释。

一、食品

l、脂肪含量小的固体样品(如大米、玉米、小米等)

1、称取1g粉碎的样品于50ml离心管中，加入10ml 的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min。

2、用Whatman No.1滤纸过滤；收集过滤液。

3、取出上清液50ul与样品稀释液450ul 充分混合30s取50ul进行分析。

          样本稀释倍数:100

2、酱油、醋

1、称取2g样品于50ml离心管中；先加入3ml去离子水充分混匀，再加入10ml三氯甲烷，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min；

2、取出下层5ml的三氯甲烷到另一洁净容器中于50℃水浴中氮气/空气吹干。

3、加入1mL的50%甲醇溶液将充分溶解干燥物。

4、取50ul与样品稀释液950ul 充分混合30s，取50ul进行分析。

          样本稀释倍数:20

3、食用油(如菜油、麻油、色拉油、花生油等)

1、称取1g油样品于50ml离心管中，先加入5ml 正己烷，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min；室温4000r/min以上，离心10min。

2、取下层溶液50ul与样品稀释液450ul 充分混合30s取50ul进行分析。

     样本稀释倍数:100

4、酒类（葡萄酒、啤酒、黄酒）

1、称取2g酒样品于50ml离心管中；加入10ml三氯甲烷，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min；

2、取出下层5ml的三氯甲烷到另一洁净容器中于50℃水浴中氮气/空气吹干。

3、加入1mL的50%甲醇溶液将充分溶解干燥物。

4、取50ul与样品稀释液950ul 充分混合30s，取50ul进行分析。

      样本稀释倍数:20

5、花生

1、称取1g粉碎的样品于50ml离心管中，先加入5ml 正己烷，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min；室温4000r/min以上，离心10min。

2、取下层溶液50ul与样品稀释液450ul 充分混合30s

      取50ul进行分析。

     样本稀释倍数:100

6、月饼、桃酥、花生酱等

1、称取2g粉碎的样品于50ml离心管中，先加入5ml 正己烷，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min；室温4000r/min以上，离心10min。

2、取下层5mL提取液于50ml离心管中；加入10ml三氯甲烷，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min。

3、取出下层5ml的三氯甲烷到另一洁净容器中于50℃水浴中氮气/空气吹干。

4、加入1mL的50%甲醇溶液将充分溶解干燥物。

5、取50ul与样品稀释液950ul 充分混合30s，取50ul进行分析。

          样本稀释倍数:40倍

7、面粉

1、称取2g面粉样品于50ml离心管中，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min；

2、用Whatman No.1滤纸过滤；收集过滤液。

3、取过滤溶液5mL于50ml离心管中；加入10ml三氯甲烷，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min。

4、取出下层5ml的三氯甲烷到另一洁净容器中于50℃水浴中氮气/空气吹干。

5、加入1mL的50%甲醇溶液将充分溶解干燥物。

6、取50ul与样品稀释液950ul 充分混合30s，取50ul进行分析。

       样本稀释倍数:40倍

二、饲料

1、一般饲料及原料（脂肪和蛋白含量小的饲料)

1、称取1g粉碎的样品于50ml离心管中，加入10ml 的50%甲醇溶液混合；强力振荡5分钟。

2、用Whatman No.1滤纸过滤；收集过滤液。

3、取出上清液50ul与样品稀释液450ul 充分混合30s取50ul进行分析。

          样本稀释倍数:100

2、配合料及浓缩料（脂肪和蛋白含量高的饲料)

1、称取2g样品于50ml离心管中，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min；

2、用Whatman No.1滤纸过滤；收集过滤液。

3、取过滤溶液5mL于50ml离心管中；加入10ml三氯甲烷，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min。

4、取出下层5ml的三氯甲烷到另一洁净容器中于50℃水浴中氮气/空气吹干。

5、加入1mL的50%甲醇溶液将充分溶解干燥物。

6、取50ul与样品稀释液950ul 充分混合30s，取50ul进行分析。

        样本稀释倍数:40倍

三、乳制品

1、生鲜牛奶；

1、直接取50μl牛奶+950μl样品稀释液混合30s；

  2、取50μl用于检测检测分析。

       样本稀释倍数:20

2、奶粉、奶油、奶酪

1、称取5g样品于50ml离心管中，加入10ml甲醇，强力振荡5min；室温4000r/min以上，离心10min。

2、取2ml上清液，于50℃水浴中氮气/空气吹干。

3、用1ml正己烷溶解残留物，加入1ml稀释后的样品稀释液混合30s；室温4000r/min以上，离心5min，

4、取50ul下层溶液进行检测分析。

     样本稀释倍数:1

【备注】

       如根据样品的国家允许量标准判定（详见附件表），在样品测定前，用样品稀释液将样品提取液再进一步进行适当倍数稀释，即为待测样品液； 取50ul待测样品液进行定量或限量测定。

【酶标**分析程序】

测定前应须知：

1、     使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25℃）。

2、     使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。

3、     在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。

4、     在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。

黄曲霉**B1试剂盒操作步骤：

1、   将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、   按板架及需要取出微孔条，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、   配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤

        液。

4、   编号：将样本和标准品对应微孔按序编号每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、   加标准品/样本50μl/孔到各自的微孔中，然后加抗体50μl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。37℃环境中反应30min。

6、   取出将孔内液体甩干，用洗液250μl/孔洗板4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被**的气泡可用干净的枪头

        刺破）。

7、   每孔加入酶标记物100μl，盖板膜盖板后置37℃环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4-5遍（同上），用吸

        水纸拍干（拍干后未被**的气泡可用干净的枪头刺破）。

8、    显色：每孔加入A液50μl，再加B液50μl，轻轻振荡混匀，37℃环境中避光显色15min。

9、   测定：每孔加入终止液50μl，轻轻振荡，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测,在5min内读完数据）测定吸

       光度值（OD值）。

【结果判定】

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与黄曲霉**B1的含量成负相关。

1、粗略判定：

用样本的平均吸光度值与标准吸光度值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.310， 样本2的吸光度值为0.820，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.610；0.025ppb为1.350；0.05ppb为1.030；0.1ppb为0.660； 0.2ppb为0.379；0.4ppb为0.198。则样本1的浓度范围是0.2ppb-0.4ppb； 样本2的浓度范围是0.05 ppb-0.1 ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉**B1的实际含量。

2、定量判定：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以**个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉**B1标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉**B1实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

3、标准曲线：

B/B0 (%)

0.025     0.05     0.1      0.2      0.4

黄曲霉**B1(ppb) [μg/kg]

图1：黄曲霉**B1检测试剂盒的回归曲线

4、再现性：

%CV

      0    0.025   0.05   0.1    0.2    0.4

黄曲霉**B1 (ppb) [μg/kg]

图2：黄曲霉**B1检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出黄曲霉**B1检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应黄曲霉**B1浓��作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】

1、     使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、     在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、     混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、     反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、     不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、     不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、     显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、     该试剂盒*佳反应温度为37℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

 原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】

 有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。

【备注】

      如根据样品的国家允许量标准判定（详见附件表）；在样品测定前，用样品稀释液将样品提取液再进一步进行适当倍数稀释，即为待测样品液； 取50ul待测样品液进行定量或限量测定。

 附件表：黄曲霉**B1国家允许量标准    

（说明：色拉油卫生标准GB13103-91 和精练食用植物油卫生标准GB15197被GB2716－2005覆盖取代。） 

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