四环素试剂盒
产品介绍
【测定原理】
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物四环素类**将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争四环素类**抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物四环素类**的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应残留物四环素类**的含量。
【试剂盒技术指标】
规 格：96孔/盒
灵 敏 度： 0.05ppb
检测时间： 75min
四环素试剂盒样本检测下限：
组织样本（鸡、鸭、猪肉/肝、虾、鱼、鸡蛋）：
四环素 ………………………………………………1ppb
二甲胺四环素 ………………………………………1ppb
吡四环素 ……………………………………………1ppb
金霉素 ………………………………………………1ppb
脱甲基金霉素……………………………………… 2ppb
土霉素………………………………………………2ppb
强力霉素……………………………………………2ppb
牛奶、蜂蜜样本：
四环素……………………………………………… 2ppb
二甲胺四环素………………………………………2ppb
吡四环素…………………………………………… 2ppb
金霉素 ………………………………………………2ppb
脱甲基金霉素………………………………………3ppb
土霉素………………………………………………3ppb
强力霉素……………………………………………4ppb
交叉反应率：
四环素 ……………………………………………100%
二甲胺四环素…………………………………… 125%
吡四环素 ………………………………………… 110%
金霉素 …………………………………………… 100%
脱甲基金霉素…………………………………… 85%
土霉素 …………………………………………… 88%
强力霉素 ………………………………………… 49%
样本回收率：
组 织 …………………………………… 85%±20%
牛奶、蜂蜜 ……………………………… 80%±20%
四环素试剂盒【试剂盒组成】
1、 微量测试孔：1×96孔板（12条×8孔）
2、 标准溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb
3、 酶标记物 12ml…………………………红色帽
4、 抗体工作液 7ml ………………………绿色帽
5、 底物A液 7ml ………………………棕色帽
6、 底物B液 7ml ……………………黑色帽
7、 终 止 液 7ml ……………………黄色帽
8、 20X浓缩洗涤液40 ml ………………白色帽
9、 2X 浓缩复溶液 50ml ·………………蓝色帽
【 所用仪器、试剂】
具备的仪器：酶标仪、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮 吹仪、刻度移液管
微量移液器：单道 20μl～200μl、单道100μl～1000μl、多道 30～300 μl
试 剂： 甲醇、正己烷、Na2HPO4·12H2O、NaOHNaH2PO4·2H2O、NaCl
四环素试剂盒【实验前溶液配制】
配液1、20mM PBS缓冲液5.16gNa2HPO4*12H2O；0.87gNaH2PO4*2H2O;8.5gNaCl；加入蒸馏水至1000ml；用于样品提取液
的配制。
配液2、样品提取液的配制取1ml甲醇与9ml的20mMPBS缓冲液混匀。
配液3、 将2X浓缩复溶液用去离子水按1：1稀释。(1份浓缩复溶掖+1份去离子水，用于抗体的稀释和样本提取后的复溶)。
配液4、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照 1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按 所需用量配制洗涤
液。
【样本前处理步骤】
u 样本处理前须知
（a）实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，
必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。
u 样本处理：
（a）组织样本前处理方法（不用过柱）
1、 称取1±0.05g 均质后的样本于离心管中，加入4ml样品提取液，振荡5min，室温4000r/min 以上，离心10min；
2、 取1ml上清液收集于另一试管中;加入1ml 正己烷,振荡1min，室温4000r/min 以上，离心10min；
3、 取50 μl下层液体于另一容器中，加入200μl样本稀释液混合30s；
4、 取50 μl 用于分析
样本稀释倍数: 20 倍
（b）蜂蜜处理方法
1、 准确称取1±0.05g 蜂蜜样本于离心管中，加入4ml 样品提取液，强烈混合振荡5min，室温 4000r/min以上，离心10min；
2、 取出50μl 上清液于另一试管中，加入450μl样本稀释混合30s；
3、 取50 μl 用于分析
样本稀释倍数: 40 倍
（c）牛奶样品处理方法
脱脂牛奶
1、取出50μl 脱脂牛奶与1950μl样本稀释液，混30s；
2、取50 μl 用于分析
脂肪奶
3、吸取1ml 牛奶样本于离心管中；于15℃环境3000r/min，离心10min；（如果没有冷冻离心机请预先冷却后再离心)
4、取出50μl 牛奶于与1950μl样本稀释液，混合30s；
5、取50 μl 用于分析
样本稀释倍数: 40 倍
【 酶标**分析程序】
u 操作步骤：
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、按板架及需要取出微孔条，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
4、加标准品/样本50μl /孔，再加入抗体工作液50μl/孔。轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，25℃环境反应30min。
5、取出用洗涤液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被**的气泡可用干净的枪头刺破）。
6、每孔加入酶标记物100μl，盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。重复步骤6。
7、显色：每孔加入底物液A液50μl再加B液50μl，轻轻振荡混匀，25℃环境避光显色15min。
8、测定：每孔加入终止液50μl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测在5min内读完数据），测定吸光度值（OD值）。
四环素试剂盒【结果判定】
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含四环素的含量成负相关。
1、粗略判定：
用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本1 的吸光度值为0.3，样本2 的吸光度值为1.0，标准液吸光度值分别是：0ppb 为2.243； 0.05ppb 为1.816；0.15ppb 为1.415；0.45ppb 为0.74；1 .35ppb 为0.313；4 .05ppb 为0.155。则样本1 的浓度范围是1.35ppb～4.05ppb；样本2的浓度范围是0.15ppb～0.45ppb，乘以其对应的稀释倍数即为样本中四环素实际浓度。
1、定量分析：
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以**个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标，以四环素标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中四环素实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。
3、标准曲线：
B/B0 (%)
0.05 0.15 0.45 1.35 4.05
四环素(ppb) [μg/kg]
图1：四环素检测试剂盒的回归曲线
4、再现性：
%CV
四环素(ppb) [μg/kg]
图2：四环素检测试剂盒的精密度
由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出四环素检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应四环素浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。
【注意事项】
1、使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一
步操作。
3、混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。
6、不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。
8、该试剂盒*佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
【储存】
原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。
【有效期】
有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。
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