头孢类（三合一）试剂盒
产品介绍
一、概要
头孢类**是一种广谱的***，具有优良的**活性和药动学特点，对许多革兰氏阳性和革兰氏阴性及产β-内酰胺酶的**有效。头孢类**是采用破坏**细胞壁的方式杀死**。由于目前使用的检测分析法样本前处理及测定操作繁琐且费用较高，使推广应用受到限制。
本试剂盒是应用 ELISA 技术研发的新一代**残留检测产品，操作时间仅需 1.5 小时，能*大限度地减少操作误差和工作强度。
二、头孢类（三合一）试剂盒试验原理
本试剂盒采用间接竞争 ELISA 方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的头孢噻呋、头孢曲松、头孢噻肟和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗三者的抗体，加入酶标二抗后，用 TMB 底物显色，样本吸光度值与其所含残留物头孢类**的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中头孢类**的残留量。
三、适用范围
可定性、定量检测动物组织（肌肉、水产）和牛奶样本中头孢噻呋、头孢曲松、头孢噻肟的残留量。
四、交叉反应率
头孢噻呋 ……………………………………………100%
头孢曲松………………………………………………130%
头孢噻肟……………………………………………73%
头孢唑啉…………………………………………小于 0.1%
五、使用单位需自备的设备及试剂
设备：
┅┅微孔板酶标仪 450/630nm
┅┅旋转蒸发仪/氮气吹干装置
┅┅振荡器
┅┅涡旋仪
┅┅离心机
┅┅天平：感量 0.01g
┅┅刻度移液管：10ml
┅┅洗耳球
┅┅容量瓶：500ml
┅┅聚苯乙烯离心管： 2ml、50ml
┅┅微量移液器：单道 20～200μl、100～1000μl、多道 250μl
试剂：
----浓盐酸（分析纯）
----乙腈(分析纯)
----正已烷(分析纯)
----去离子水
六、头孢类（三合一）试剂盒提供的材料与试剂
1、96 孔酶标板×1 块 （包被有偶联抗原）
2、标准品×6 瓶：（1ml/瓶）0ppb，0.5ppb，1.5ppb，4.5ppb，13.5ppb，40.5ppb
3、高浓度标准品：（1ml/瓶） 1ppm：
4、酶标二抗 12ml…………………红色帽
5、抗体工作液 7ml…………………绿色帽
6、底物液 A 液 7ml…………………白色帽
7、底物液 B 液 7ml…………………红色帽
8、终 止 液 7ml…………………黄色帽
9、20×浓缩洗涤液 40ml…………………透明帽
10、2×浓缩复溶液 50ml…………………蓝色帽
七、头孢类（三合一）试剂盒溶液的配制
配液 1: 0.05 M 盐酸溶液量取 2.1ml 浓盐酸加入去离子水中定容至500ml，混匀。
配液 2: 提取工作液量取 80ml 乙腈加入 20ml 0.05M 盐酸中，混匀。
配液 3: 复溶工作液用去离子水将 2×浓缩复溶液按 1：1 体积比进行稀释（1 份 2×浓缩复溶液+1 份去离子水）用于样本的复溶，复溶工作液在 4℃（39.2℉）环境可保存一个月。
配液 4: 洗涤工作液用去离子水将 20×浓缩洗涤液按 1：19 体积比进行稀释（1 份 20×浓缩洗涤液+19 份去离子水用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在 4℃（39.2℉）
环境可保存一个月。
八、样本前处理步骤
样本处理前须知
处理任何样本时，都必须注意：
（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。
（c）未处理的样本需冷冻环境保存。
（d）处理好的样本应立即用于检测，不易保存。
（一）动物组织（鸡肉、猪肉、牛肉、鱼、虾）样本前处理方法
-----称取 2.0±0.05g均质后的组织样本至 50ml 聚苯乙烯离心管中，加入 8ml 提取工作液（见配液 2），用振荡器振荡 5min，3000g离心 5min；
----移取 1ml 上清至 10ml 洁净干燥玻璃试管中， 50-60℃于（122-140℉）水浴氮气流下吹干；
----加入 1ml 正己烷，用涡旋仪涡动 30s 溶解干燥残留物，再加入 1ml 复溶工作液（见配液 3）用涡旋仪涡动 30s，3000g离心 5min；
-----除去上层有机相，取下层水相 50μl 用于分析。
（二）牛奶样本处理方法
----移取 100μl 鲜牛奶至 2ml 离心管中，再加入 900μl 复溶工作液（见配液 3），混匀。
----取 50μl 用于分析。
九、头孢类（三合一）试剂盒检测步骤
测定前应须知：
1、使用之前将模具内所有试剂与酶标板放实验桌回温至室温（20-25℃/68-77℉）。
2、使用之后立即将所有试剂放回 2-8℃(36-46℉)。
3、在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是 ELISA 测定程序中的要点。
4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。
操作步骤：
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，按照上述方法进行回温，注意每种液体试剂使用前均需摇匀。
2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放回铝箔袋重新真空密封，保存于 2-8℃（36-46℉）环境中。
3、浓缩洗涤液和浓缩复溶液使用前也需按上述方法回温。
4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做 2 孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5、加标准品/样本和抗体工作液：加标准品/样本 50μl 到对应的微孔中，然后加入抗体工作液 50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 4-8℃（36-46℉）避光环境中反应 30min。
6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液（见配液 4）250μl/孔，充分洗涤 4－5 次，每次间隔 10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干（拍干后未被**的气泡可用未使用过的枪头戳破）。
7、加酶标二抗：加入酶标二抗 100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃（77℉）避光环境中反应30min，取出重复洗板步骤 6。
8、显色：加入底物液 A 液 50μl/孔，再加入底物液 B 液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，25℃置（77℉）环境中反应 15min（见注意事项 8）。
9、测定：加入终止液 50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm 处（建议用双波长 450/630nm 检测，请在5min 内读完数据），测定每孔 OD 值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。
十、结果判定
结果判定有两种方法,粗略判定可用第 1 种方法，定量判定用第 2 种方法。注意样本吸光度值与其所含头孢三合一的含量成负相关。
1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本 1 的吸光度值为 0.110， 样本 2 的吸光度值为 0.820， 标准品吸光度值分别是：0ppb 为1.880；0.5ppb 为 1.360；1.5ppb 为 0.986；4.5ppb 为 0.509；13.5ppb 为 0.190；40.5ppb 为 0.079。则样本 1 的浓度范围是 13.5ppb-40.5ppb 再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中头孢类**残留的浓度范围；样本 2 的浓度范围是1.5ppb-4.5ppb 再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中头孢类**残留的浓度范围。
2、定量分析
（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以**个标准品（0 标准）的吸光度值的平均值，再乘以 100%，
即百分吸光率（%）＝B/ B0 ×100%
B—标准品或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ppb 标准溶液的平均吸光度值
（2）标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，以头孢三合一标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中头孢三合一的实际浓度。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）
十一、检测方法灵敏度、准确度、精密度
试剂盒灵敏度：0.5ppb
样本*低检测限：
动物组织………………………………………2ppb
牛 奶 …… …… … …… …… … …… …… …… … …5 p p b
准确度：
动物组织（鸡肉、猪肉、牛肉）………75% ±10%
动物组织（鱼 、虾）……………………… 70%±1 0%
牛奶 …………………………………… 90% ±10%
精密度：
试剂盒的板内、板间变异系数均小于 10%。
十二、注意事项
1、室温低于20℃（68℉）或试剂及样本的温度没有回到室温（20-25℃/68-77℉）会导致所有标准的 OD 值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、每加一种试剂前需将其摇匀。
4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、不要使用超出有效期的试剂盒；也不要使用超出有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用超出有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
6、储存条件保存试剂盒于 2-8℃（36-46℉），不要冷冻，将不用的微孔板放回铝箔袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、试剂变质的迹象发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0 标准的吸光度（450/630nm）值小于 0.5 （A450nm<0.5 ）时，表示试剂可能变质。
8、在加入底物液 A 液和底物液 B 液后，一般显色时间为15min 即可。若颜色较浅，可延长反应时间到 20min（或更长），但不得超过 25min。反之，则减短反应时间。
十三、贮藏条件及保存期
贮藏条件：保存试剂盒于2~8℃（36-46℉）环境中。
保 存 期：有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。
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