体外细胞培养操作要点

细胞培养是生物医学研究人员必须掌握的一项基本技能，是实验成功与否的关键。所以，了解细胞培养的基本操作要领，对生物医药科研工作者，特别是对基础研究工作者来说，显得尤为重要。文章从实际操作的角度谈谈体外细胞培养操作要点。

一、试验前的准备

一般细胞生长环境为5%的二氧化碳，37℃恒温及饱和湿度。在细胞培养开始之前，实验人员必须查阅资料，了解细胞培养的习惯，如贴壁、半贴壁、悬浮物等。理解细胞生长的营养条件，大多数细胞为10%胎牛血清+89%培养液+1%抗生su。培养基的种类当然很多，高糖、低糖、分化培养基、干细胞培养基等等。依据细胞生长条件，预选适宜的消耗材料，如促贴壁或低吸附培养瓶、培养皿、培养板等。对这些细胞进行处理前，计算出这次处理所需的细胞生长培养基总量，并将生长培养基进行配比。

二、细胞消化

与悬浮细胞相比，贴壁细胞的传代步骤较多，应避免不必要的细胞污染。传代操作可以在细胞生长集中程度达到80-90%左右的时候进行。由于细胞生长具有浓度依赖关系，过或过早传代都会影响细胞状态。取细胞培养盒， PBS清洗2次。此时将细胞培养瓶中的液体吸净，可采用真空泵、移液管、一次性吸管等，但无论采用何种吸净方法，均应避免操作手触碰瓶口而造成污染，吸头触碰细胞面而造成细胞机械损伤。将液体吸净，加入适量胰蛋白酶。胰酶不宜过多，只需少量滴在培养瓶上，倾斜培养可使细胞面覆盖。细胞可以在这个时候放置在培养箱里，37℃条件下有利于胰蛋白酶的消化。大约2分钟就可以消化了。自然地，有些细胞更容易消化，可能消化过程只需要30秒，如TC-1、MC-38等肿瘤细胞株；另一些则消化得更慢，如培养的间充质干细胞(MSCs)。如何判断细胞消化过程是否已经结束？在倒置显微镜下我们可以看到细胞的形态，大多数的细胞由多角形转变为卵圆形，可见细胞浮通过肉眼还可以直接观察到细胞面从光滑到毛玻璃状的变化。此可加入适量完全的培养基终止胰蛋白酶消化，基本上可加3-5毫升。加水轻轻吹吸后移至离心管进行离心，基本可将离心1000转离心3分钟即可分离细胞，转速不宜过高，否则细胞碎片会随离心下坠。离心性反应后弃上清液。此时可直接倒入，然后用移液枪清洗残余液体。

三、接种

对上述细胞沉淀物进行重悬。可借助于旋涡震荡仪进行重悬，也可在重悬细胞前用手指轻弹离心管底部，再加入适量的培养基重悬，切忌直接加入培养基后用移液枪吹干。在2-3个培养瓶中，将重悬好的细胞全部分离，补全生长培养液继续培养。约8-10毫升的培养液用于T25培养，20-25毫升的培养液用于T75培养。注射后，十字混匀，每日镜下观察细胞状况。传代比例可根据细胞生长规律进行调节，如快速生长的肿瘤细胞株，可按1:5甚至1:10的比例进行传代。但原代培养的细胞生长较慢，可在1:2甚至2:3传代。