PCR实验步骤
PCR即聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)不仅是DNA分析*常用的技术,而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。
1. PCR体系中的5个要素: 模板(Template),引物(Primer),酶(polymerase),dNTP,缓冲液(Buffer,含有Mg2+)。现在许多公司已推出酶、dNPT、Buffer配成的Mix Buffer,使用更为方便。
2. 20uL的PCR反应体系:
模板DNA 2μL
引物1 1μL,10~100pmol
引物2 1μL,10~100pmol
dNTP 1.5μL,各200umol/L
MgCl2 2μL
10×buffer 2μL
ddH2O 10μL
Taq酶 0.5μL(2.5U)
在PCR管中依次加入上述溶液,Taq酶*后加入。
3. PCR反应条件:
预变性:95℃ 3min
变性:95℃ 45s
退火:45℃ 45s
延伸: 72℃ 45s
延伸完全:5min
结束:4℃
其中变性-延伸过程循环30次。
现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是*佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度.