即用型PCR试剂盒3.0使用说明书

产品及特点

本产品是在本公司即用型PCR试剂盒2.0的基础上改良而来，内含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、反应缓冲液、PCR增强剂、上样染料等所有PCR所需要的成分, 用户只需加入模板和引物即可进行PCR反应, 具有广泛的用途。

1. 扩增效率和灵敏度更高。

2. 方便，用户只需准备模板和引物既可以进行PCR实验。

3. 快捷，操作步骤已经*大限度地简化，能减少污染，降低实验误差。

4. 本产品A型含电泳染料,PCR反应液可直接上样电泳，进一步简化了操作。

5. 产物可直接用于T载体克隆，不需要额外的加A反应。

6. 染料单独提供，方便客户组合。

规格及成分

注：本产品分A和B两种

A型产品：PCR MagicMix 3.0中直接加入了专用染料；

B型产品：PCR MagicMix 3.0中没有加入专用染料，染料单独提供

运输及保存

低温运输，-20℃保存, 有效期一年。

自备试剂

DNA模板、引物、超纯水。

使用方法

 以30 uL的标准PCR反应体系为例：在一干净的PCR管中，加入下列成分：

放入PCR仪中进行PCR, 结束后取5-10 uL直接上样电泳（A型产品不需要额外再加DNA上样液）, 红色染料电泳速度相当于50 bp DNA片段。B型产品用户按照1.5 mL PCR MagicMix 3.0加入60 uL专用染料的比例将60 uL专用染料加入到1.5 mL PCR MagicMix 3.0中。

注意：

1．如果反应体系不是30 uL，各成分需要等按比例增加或减少。

2．如果DNA模板中有PCR不明抑制物（植物、土壤和血液等DNA样品常含此类抑制物），可以在PCR体系中加入1/10的PCR抑制物**剂（CAT#：60804，30uL体系中加3uL），可能会对PCR有帮助。

相关资料

PCR反应的影响因素

变性温度与时间：模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。变性温度太高，又会影响酶的活性。一般情况下可设为94℃ 20~30秒，高温时间应尽量缩短，以保持耐热DNA聚合酶的活力，*高变性温度不宜超过95℃。

退火温度与时间：退火温度决定PCR特异性与产量。温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。合适的退火温度一般在45~68℃之间。设置特定反应的*适退火温度，可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为30~60秒，足以使引物与模板之间完全结合，长时间退火没有必要。

延伸温度与时间：PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间，延伸时间根据所用聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定，如同样扩增2 Kb片段，若使用Taq酶只需1分钟，使用Pfu酶则应设定2分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现，时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。

循环次数：可根据模板DNA的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素，设定20-40个循环。循环次数太少，扩增量不足，如果循环次数太多，错配几率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。

酶量：50 μL反应体系可用0.5-5 U酶，酶量的选择与模板DNA的量，扩增片段大小等有关，酶量过多易发生非特异性反应，而且可能增加突变的机率，尤其在进行高保真扩增时，应尽量减少酶量，但酶量过少时反应性能下降。

模板：模板可以是单链DNA，也可以是双链DNA，质粒DNA的扩增效率略低于线状DNA。模板加量一般不需太多，不超过1 μg为宜，因为加量过多可能导致非特异性扩增增加，但是要考虑模板中靶序列的含量。例如，使用基因组为模板扩增单拷贝或低拷贝靶序列，就需要适当加大模板用量。

引物：引物与模板配对的长度应至少为17个核苷酸，*高不宜超过30个核苷酸，*佳长度为20~24个核苷酸，如需插入酶切位点，应在酶切位点5’端多加几个碱基，有利于酶切。引物的（G+C）%含量组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。引物内部应避免形成明显的次级结构，如发夹结构。两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端。如果可能，引物3’端*好富有GC，这样退火后有利于引物3’端的延伸。人工合成的引物*好经过色谱层析纯化或PAGE纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。引物的终浓度一般为0.1-2 μM左右，浓度太高会导致非特异性扩增，太低则扩增产物太少。

关联产品

PCR Inhibitor Erasol (CAT#:60804)。