1. 估算组织细胞的用量。每次微量提取一般需要100-200 mg植物叶片、或50-100 mg植物种子、或200-500 mg植物果实。
2. 样品破碎:
1) 匀浆法:先将新鲜植物组织剪切成小块(保存在RNALOCKER中的植物组织需用纸吸去RNALOCKER液体后再剪切成小块),放入10-15 mL塑料离心管中,加入1 mL溶液A,然后用匀浆器匀浆5-20秒。匀浆时会产生泡沫,但不影响提取效果。
2) 液氮研磨法(适用于复杂,易降解样品):取适量新鲜植物组织放入含液氮的研钵中,迅速将组织研磨成粉末后,将粉末转移到合适的塑料离心管中,加入1 mL溶液A,立即剧烈振荡20秒,充分混匀。
注意:溶解溶液A沉淀。如果把溶液A放在4℃放置,一段时间后可能会产生沉淀,此种情况下使用前必须放在65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用。
3. 将匀浆物或研磨物转移至干净的1.5 mL塑料离心管中(可以不必转移非液体的细胞碎片)。有的植物组织(比如果实)含有大量水份,匀浆液会多于1 mL,转移时也只取1 mL。
4. 在离心管中加入0.3 mL的溶液B和0.2 mL自备氯仿,在振荡器上振荡30秒混匀,此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。
5. 室温12000 rpm离心3-5分钟,两相间将有约5毫米厚的细胞破碎物。
6. 将上清液(约0.6 mL)转移到另一干净的1.5 mL塑料离心管中,下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质,避免触及或吸取。*好留下100 uL上清液不取。
7. 加入跟上清液等体积的溶液C,充分颠倒混匀。如果有沉淀产生(对某些植物,属于正常现象),千万不要去掉沉淀,一定要把所有的混合物上柱。
8. 将一半的混合液(含沉淀物,如果有的话)转移到离心吸附柱中,12000 rpm室温离心半分钟,弃穿透液。
9. 将剩下的一半的混合液(含沉淀物,如果有的话)转移到同一离心吸附柱中,12000 rpm室温离心半分钟,弃穿透液。
10. 加0.7 mL通用洗柱液,12000 rpm室温离心半分钟,弃穿透液。再加0.3 mL通用洗柱液,12000 rpm室温离心半分钟,弃穿透液。一般样品如此洗涤两次即可,但对于在第7步加入溶液C后有沉淀产生的样品,则需要洗三次,每次加入的通用洗涤液的量分别为0.4、0.3和0.3 mL,其他操作不变。
11. 12000 rpm室温离心10秒以便去除残留液体。此步很重要,否则残留的通用洗柱液会抑制后续反应中DNase的活性。
12. 将10 uL(10 U)的RNase-free DNase加入到50 uL 37℃预热的DNA膜反应液中,吹打混匀配制成DNase工作液。
13. 将DNase工作液在37℃预热1分钟,然后全部加入到离心吸附柱中,室温放置5分钟。注意:5分钟一般足够降解大多数情况下的DNA污染。如果DNA没有彻底降解(可能由于样品中残留的杂质抑制了DNase的活性),此步的保温时间可以适当延长到10分钟或15分钟。
14. 直接在离心吸附柱中加0.7 mL通用洗柱液,盖上盖后颠倒数次混匀。
15. 12000 rpm室温离心半分钟,弃穿透液。
16. 再加0.3 mL通用洗柱液到离心吸附柱中,12000 rpm室温离心半分钟,弃穿透液。
17. 12000 rpm室温离心半分钟。此步十分重要,否则残留的乙醇(通用洗柱液中的成分)会影响RNA的使用。
18. 将离心吸附柱转移到RNase-free收集管中,加入30-50 uL RNA洗脱液,室温放置1-2分钟。
19. 12000 rpm室温离心半分钟,离心管中溶液即为RNA样品。本产品提供的离心吸附柱吸附力较强,一次洗脱不能全部将膜上RNA洗下,如有必要,可以再加入30-50 uL RNA洗脱液一次。
20. 所得RNA溶液可以立即使用或存放于-80℃待用。如果要进行甲醛变性电泳检测。如果使用非变性胶电泳,则必须使用RNAon上样液。千万不能使用DNA上样液(因为它一般没经过去RNase处理)。
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