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柱式植物RNAout 2.0使用说明书

柱式植物RNAout 2.0使用说明书

Column Plant RNAout 2.0

产品及特点

本产品是天泽基因柱式植物RNAOUT(CAT#:71203)与柱式DNA**剂(CAT#:90318)整合后得到的升级产品,它解决了提取的植物总RNA中出现基因组DNA污染这一难题,提取的RNA通过PCR验证不含基因组DNA污染。该产品特点如下:

1. 操作简单快速,处理一个样品只需要约十分钟。

2. RNA纯度更高,平均 OD260/280一般都2.0左右,能够有效去除大多数植物中的多糖污染。

3. 所提取RNA不含基因组DNA污染(电泳及PCR均检测不到)。

4. 得到的RNA可直接用于RT-PCR、Northern杂交、cDNA合成实验

5. 性价比高于进口的柱式植物RNA提取产品。

6. 本试剂盒方法提取不到总RNA中的miRNA。

规格及成分

成 份

编 号

50次大纸盒包装

溶液A

71203A

50 mL

溶液B

71203B

15 mL

溶液C

71203C

50 mL

离心吸附柱

60911

50套

通用洗柱液

60408

100 mL

DNase膜反应液

90404A

2.5 mL

RNase-free DNase

(1U/uL

90903

0.5 mL

RNA洗脱液

71207

10 mL

使用手册

90404sc

1份

 

运输及保存

常温运输和保存,但RNase-free DNase 和DNase膜反应液需要-20℃保存,有效期一年

自备试剂

氯仿

使用方法

1. 估算组织细胞的用量。每次微量提取一般需要100-200 mg植物叶片、或50-100 mg植物种子、或200-500 mg植物果实。

2. 样品破碎:

1) 匀浆法:先将新鲜植物组织剪切成小块(保存在RNALOCKER中的植物组织需用纸吸去RNALOCKER液体后剪切成小块)放入10-15 mL塑料离心管中,加入1 mL溶液A,然后用匀浆器匀浆5-20秒。匀浆时会产生泡沫但不影响提取效果。

2) 液氮研磨法(适用于复杂,易降解样品):取适量新鲜植物组织放入含液氮的研钵中,迅速将组织研磨成粉末后,将粉末转移到合适的塑料离心管中,加入1 mL溶液A,立即剧烈振荡20秒,充分混匀。

注意:溶解溶液A沉淀。如果把溶液A放在4℃放置,一段时间可能会产生沉淀,此种情况下使用前必须放在65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用

3. 将匀浆物或研转移至干净的1.5 mL塑料离心管中(可以不必转移非液体的细胞碎片)。有的植物组织(比如果实)含有大量水份匀浆液多于1 mL,转移时也只取1 mL

4. 在离心管中加入0.3 mL的溶液B和0.2 mL自备氯仿,在振荡器振荡30秒混匀,此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。

5. 室温12000 rpm离心3-5分钟两相间将有约5毫米厚的细胞破碎物。

6. 将上清液(约0.6 mL)转移到另一干净的1.5 mL塑料离心管中下层有机相和中间层含有DNA蛋白质和其他杂质避免触及或吸取。*好留下100 uL上清液不取。

7. 加入跟上清液等体积的溶液C,充分颠倒混匀如果有沉淀产生(对某些植物,属于正常现象),千万不要去掉沉淀,一定要把所有的混合物上柱。

8. 将一半的混合液(含沉淀物,如果有的话)转移到离心吸附柱中,12000 rpm室温离心分钟,弃穿透液

9. 将剩下的一半的混合液(含沉淀物,如果有的话)转移到同一离心吸附柱中,12000 rpm室温离心分钟,弃穿透液

10. 加0.7 mL通用洗柱液,12000 rpm室温离心分钟,弃穿透液0.3 mL通用洗柱液,12000 rpm室温离心分钟,弃穿透液一般样品如此洗涤两次即可,但对于在第7步加入溶液C后有沉淀产生的样品,则需要洗三次,每次加入的通用洗涤液的量分别为0.4、0.3和0.3 mL,其他操作不变。

11. 12000 rpm室温离心10秒以便去除残留液体。此步很重要,否则残留的通用洗柱液会抑制后续反应中DNase的活性。

12. 将10 uL(10 U)的RNase-free DNase加入到50 uL 37℃预热的DNA膜反应液中,吹打混匀配制成DNase工作液。

13. 将DNase工作液在37℃预热1分钟,然后全部加入到离心吸附柱中,室温放置5分钟。注意:5分钟一般足够降解大多数情况下的DNA污染。如果DNA没有彻底降解(可能由于样品中残留的杂质抑制了DNase的活性),此步的保温时间可以适当延长到10分钟或15分钟。

14. 直接在离心吸附柱中加0.7 mL通用洗柱液,盖上盖后颠倒数次混匀。

15. 12000 rpm室温离心分钟,弃穿透液

16. 再加0.3 mL通用洗柱液到离心吸附柱中,12000 rpm室温离心分钟,弃穿透液

17. 12000 rpm室温离心分钟。此步十分重要,否则残留的乙醇(通用洗柱液中的成分)会影响RNA的使用。

18. 将离心吸附柱转移到RNase-free收集管中,加入30-50 uL RNA洗脱液,室放置1-2分钟

19. 12000 rpm室温离心分钟,离心管中溶液即为RNA样品。本产品提供的离心吸附柱吸附力较强,一次洗脱不能全部将膜上RNA洗下,如有必要,可以再加入30-50 uL RNA洗脱液一次。

20. 所得RNA溶液可以立即使用或存放于-80℃待用。如果要进行甲醛变性电泳检测。如果使用非变性胶电泳,则必须使用RNAon上样液。千万不能使用DNA上样液(因为它一般没经过去RNase处理)。

关联产品

mRNA提取试剂盒(CAT#:80817)