绿如蓝核酸染料使用说明书

产品及特点

目前*常见的替代EB的核酸染料SYBR Green I（属于花氰类染料）虽然毒性比EB低、灵敏度比EB高，但由于其化学稳定性差（怕光、怕水、怕热），实验结果的重复性往往不尽人意；此外，SYBR Green I在电泳过程中能在DNA分子间移位，很容易使DNA条带模糊和扭曲，电泳清晰度和分辨率也不如EB。所以在实际应用中依然不能有效替代EB。本产品是同时具有EB稳定性和SYBR Green I低毒性的新性核酸染料，其特点如下：

1. 低毒。其主要成分未发现对人体有致癌性、未被列入有毒有害品，有利于保护使用者的健康和保护日益恶化的环境。

2. 灵敏。检测灵敏度跟EB相当，能满足常规核酸电泳实验要求。

3. 稳定。对光、水和热的稳定性跟EB相当，可加入琼脂糖凝胶中反复熔化。

4. 无分子间位移现象。不会出现SYBR染料常见的条带模糊和扭曲现象。

5. 使用方法多样。既可以加入熔化的胶中，也可以电泳后染色，还可用于PAGE。

6. 跟各种常用的核酸电泳缓冲液（如SuperBuffer-2、TBE、TAE）兼容，但在SuperBuffer-2和TBE中背景*低。

7. 观察时不需要任何额外的仪器设备或UV光源，可以使用现成的观察EB的300nm UV。

8. 可用于RNA染色(也呈绿色)。

9. DNA或RNA浓度较高时还可以直接在日光下观察（需要将胶放在黑色背景下）。由于避免了UV对DNA的伤害，尤其适用于胶回收实验。 

规格及成分

运输及保存

常温运输，4℃保存，有效期一年。

自备试剂

电泳缓冲液和琼脂糖凝胶

使用方法

注意:虽然本产品的主要成分未发现对人体有致癌性、未被列入有毒有害品，但操作时*好还是戴上塑料手套。

使用方法之一：电泳中染色DNA （RNA的染色跟DNA完全一样）。

本方法是将DNAGREEN直接加入溶化的凝胶中使用，只适用于琼脂糖凝胶电泳，不适用于PAGE。

1. 将DNAGREEN直接加入到融化的琼脂糖凝胶中，每100mL凝胶加3-10 uL DNAGREEN，混合均匀后倒胶。琼脂糖凝胶中不能含任何其他染料（如EB和SYBR Green I，否则会相互干扰）。在100mL琼脂糖凝胶中加入DNAGREEN的量不要超过10 uL，否则背景将很强。注意：一定要保证琼脂糖彻底熔化，尤其是在**次熔化胶的时候，否则未熔化的小颗粒将产生跟染料相同的荧光。

2. 将DNA样品与DNA上样液按比例混合后上样。注意：一定要使用不含SDS等去污剂的上样液，否则SDS会跟染料结合，极大地降低灵敏度。

3. 上样后电泳，电泳参数同常规的电泳。如果使用天泽基因五分钟核酸电泳液SuperBuffer-2，需要较高电压，详见该产品使用手册。

4. 电泳结束后在300 nm左右 的UV下观察。注意：不要使用波长为260 nm或360 nm的UV，否则检测灵敏度会降低。如果DNA或RNA浓度较高，还可以直接在日光下直接观察（需要将胶放在黑色背景下），避免UV对DNA的伤害，尤其适用于胶回收实验。

注：显色结果：在紫外下，DNA浓度非常高的时候是白色，浓度低的时候是绿色的，单链核酸有时是红色的。

5. 用配置了520-550 nm滤光片（一般呈黄色或深黄色）的相机拍照。注意：不要使用与EB兼容的红色滤光片（它能阻挡520-550 nm的光）。如果能再加上能滤去UV的滤光片，效果会更好。

6. 后续Southern、转膜或DNA胶回收实验按常规操作进行。

使用方法之二：电泳后染色DNA

本方法是在电泳后对DNA进行染色，适用于琼脂糖凝胶电泳和PAGE。但该方法需要单独的染色处理，染料用量较大，不推荐用于琼脂糖凝胶的染色。

1. 按照常规方法进行电泳。

2. 用去离子水将DNAGREEN稀释500倍后（100 mL水需要加0.2 mL DNAGREEN），将凝胶放入，室温下摇晃染色30分钟（对琼脂糖凝胶）或15分钟（对PAGE）。

3. 用水脱色10-30分钟，具体时间需根据背景强弱决定，其余同方法一。

注意：电泳后染色液可以反复使用次数。

疑难解答

Q：本产品可否用于RNA染色？

A： 可以，不论RNA是在甲醛变性胶中电泳，还是在普通的SuperBuffer-2、TBE或TAE胶中电泳，RNA染色后在300nm下都跟DNA一样呈绿色，

Q：本产品是否可以加入上样液中进行染色？

A：不行，本产品只能直接加入凝胶中进行染色或电泳后再染色。

Q：为何前端（靠近正极）的DNA条带很淡或根本看不见？

A：跟EB一样，电泳时DNAGREEN朝负极方向移动，当前端的DNA（*小片段）进入没有DNAGREEN的区域时，已经结合的染料分子会逐渐从DNA分子上脱落，所以条带会变淡或根本看不见。解决办法之一是缩短电泳时间或电泳后再染色；之二是在每100 mL电泳缓冲液中补加3-5uL染料。

Q：本产品在哪种缓冲液中效果*好？

A：DNAGREEN染料在不同缓冲液中背景荧光强度不同，从弱到强的顺序是：SuperBuffer-2、TBE、TAE。在背景较强的缓冲液体中，可以适当降低染料的用量，比如100mL胶中加3-5 uL。*佳浓度需要稍做摸索。

Q: 为何电泳后前面部分（靠近正极）的胶呈白色，后面的胶呈黑色？

A: DNAGREEN染料带正电，电泳时往上走，胶的黑色部分是染料上移后留下的无染料胶。本产品在TAE中背景*强，可参考上个问题答案更换电泳液以降低背景值。

Q：用SYBR染色的DNA在电泳时为何容易发生条带模糊和扭曲现象？

A：SYBR染料一般与DNA的小沟结合，但在常规电泳条件下该结合并不牢固，染料分子可以在标记的和未标记的DNA分子之间转移，使DNA分子的泳动速度时快（无染料结合时）时慢（有染料结合时），发生条带模糊和扭曲现象。嵌入型染料（如EB和本产品）与DNA结合牢固，则无此现象。

Q：核酸染料是否都有毒性？

A：核酸染料对动物和人的毒性由多方面决定。一是染料的膜通透性，EB被归类为强诱变剂是由于其分子量较小，容易进入细胞内。而EB二聚体Ethidium Homodimer（EthD）嵌入DNA的能力比EB强上千倍，但毒性很小，就是由于其分子比EB大，不能透过细胞膜，所以毒性反而更低。SYBR系列染料虽然低毒，但由于一般都溶于DMSO（因为容易水解，不能使用水溶液做溶剂）中，所以如果溅到皮肤表面，更容易进入皮肤。二是染料是否容易被人体降解。比如EB在体外就很难降解，一旦进入体内能在人体内残留的时间可能比较长，增加了毒性；而SYBR Green I等染料（也能以嵌入方式与DNA结合）由于不稳定，比较容易自然降解，所以毒性自然较低。三是降解产物是否有毒性，比如用很多方法（如强碱法）降解EB得到的产物有的比EB毒性更大，而有的染料降解产物毒性却低很多，甚至无毒。四是染料进入细胞核以后是否能跟DNA结合，很多实验结果显示即使EB染料也很难嵌入型到染色体中，因为染色体中的DNA已经紧密地与各种组蛋白结合。五是细胞修复突变的能力，正常人体都有很强的修复突变的能力，如修复日光中UV诱导的DNA突变。总之，一种DNA染料的毒性强弱是多种因素综合的结果。

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