即用型荧光PCR试剂盒使用说明书

产品及特点

本产品是基于荧光染料检测的即用型PCR试剂盒，可以对基因组DNA靶序列和RNA反转录后cDNA靶序列进行实时定量PCR分析（quantitative PCR、qPCR）。本产品含有经过优化的缓冲液组分、优化的Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、SYBR Green I和稳定剂等成分。本产品中优化的Taq DNA Polymerase高温加热前，抗Taq 单克隆抗体与Taq结合，抑制Taq聚合酶活性，从而抑制在低温条件下出现的由引物和模板DNA之间的非特异性杂交或引物二聚体引起的非特异性扩增。而且抗体在PCR反应的预变性步骤中能完全失活，不会阻碍之后Taq DNA聚合酶的活性，大大提高了 PCR 反应的灵敏度及特异性。

1. 方便，用户只需准备模板和引物既可以进行实时定量PCR实验和HRM（High Resolution DNA Melt Curve Analysis）分析。而基于SYBR Green I和LC Green染料的qPCR mix则不能同时用于上述两种实验。

2. 使用抗Taq抗体封闭的优化的Taq DNA聚合酶，可抑制低温条件下的非特异性扩增。

3. 使用第三代饱和型荧光染料，信号强，不会抑制PCR反应。

4. 快捷，即用型的预配液使加样操作步骤大大简化，避免了交叉污染，降低实验误差。

5. 各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。能检测到浓度为50拷贝/mL的靶分子。

规格及成分

运输及保存

低温运输，-20℃保存, 保存期限为6个月。

自备试剂

DNA模板、引物、超纯水。

使用方法

1. 以20 uL的qPCR反应体系为例：在一干净的PCR管中，加入下列成分：

放入荧光PCR仪中进行扩增, 并在退火或延长步骤中记录荧光信号。

注意：

a) 通常引物浓度以0.2 μM可得到较好结果，可以终浓度0.1-1.0 μM作为设定范围的参考；通常DNA模板的量以10-100 ng基因组DNA或1-10 ng cDNA为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定*佳的模板使用量。

b) ROX 校正染料：如果使用ABI公司的7500，7700和7900三种型号的荧光PCR仪器，则需用自备的ROX进行Ct值校正。对ABI 7700和7900，ROX的*佳浓度为1×（即在每20 uL 反应体系中加2 uL 10×ROX）。对ABI 7500， ROX的*佳浓度为0.05-0.1×（每20 uL 反应体系加0.1-0.2 uL 10×ROX；也可将10×ROX稀释到1×，然后每个反应体系加入1-2 uL 1×ROX）。ROX会在溶解曲线中产生噪音，因此，如果出现了杂峰，将软件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”选项取消打勾，然后重新分析数据。

对于iCycler IQ，MJ Opticon，MJ Chromo4，MX3000，MX4000, RotorGene3000，RotorGene 6000 和 LightCycler 480等型号的荧光PCR仪器，ROX不是必须的，但加入的话也不会影响整个PCR分析。

2. 循环步骤：根据扩增子的性质和仪器性能，从以下三个过程中任选一个进行扩增。

A：两步快速循环法：适用于引物Tm值设计为60℃的反应

注意：本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、10 min条件下实现酶的活化。退火温度请以60-64℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时，可提高退火温度。

B：三步快速循环法：适用于延伸步骤温度高于退火步骤的PCR（长引物PCR）

注意：

a) 退火温度：建议采用两步法PCR，退火温度60℃进行反应。若提高反应特异性，可提高退火温度，以60-64℃作为设定范围的参考。若因使用Tm值较低的引物等原 因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，三步法的退火温度请以56℃-64℃的范围作为设定参考。延伸温度：延伸温度设为72℃通常可以提高扩增效率。但是，对于AT含量大于70%的扩增子来说，延伸温度设为60℃为宜。

C：通用循环法：这种循环方法适用于几乎所有的荧光PCR仪，也适用于用快速循环法不能扩增的模版。

3. 数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在没结合DNA时，*大吸收光谱在471nm，结合DNA时的*大吸收光谱在500nm，*大发射光谱在530nm。

其他注意事项：

1. 如果使用iCycler，可以不加入FAM。

2. 如果使用Roche LightCycler的玻璃毛细管进行PCR，需加入终浓度为0.5mg/mL的自备BSA。

关联产品

即用型PCR2.0、PCR级绿如蓝染料。