IFN-β对猪血凝性脑脊髓炎病毒感染巨噬细胞的影响及其抗病毒效果研究
唐博 吉林大学 摘要：猪血凝性脑脊髓炎是由猪血凝性脑脊髓炎病毒（Porcine hemagglutinatingencephalomyelitis virus，PHEV）通过感染宿主的**神经系统（Central nervoussystem，CNS）而引起的一种急性、高度接触性传染病，具有典型的嗜神经特性，死亡率可高达20%~100%，给畜牧业造成了巨大的经济损失，亟需一种高效的抗病毒**来预防和**该病。天然**反应是早期防御病毒感染的**道防线，IFN-β除了能通过抑制病毒的吸附、脱壳、转录等环节抑制病毒复制作用以外，还可以通过加强宿主体内自然杀伤性细胞的吞噬作用来杀伤病毒，因此IFN-β是影响抗病毒效果的关键因素之一。前期实验发现PHEV感染树突状细胞以及N2a细胞过程中也有相似的逃避**监视并抑制IFN-β现象，因此PHEV对IFN-β的**逃逸有可能是导致**抑制因素之一。目前尚不明确PHEV导致神经系统损伤之前宿主的抗病毒**机制，因此拟建立的PHEV体内动物感染模型和体外细胞感染模型不仅有利于研究PHEV**逃避机制，而且为进一步探究IFN-β是否参与PHEV抗病毒**具有重要的意义。首先，本实验利用PHEV-67N株感染巨噬细胞（J774A.1细胞），并在感染后的不同时间，通过光学显微镜观察、TCID50、**荧光（IFA）、ELISA和荧光定量PCR等方法，分别从病毒抗原分布、病毒感染滴度变化以及mRNA和蛋白水平对PHEV在J774A.1细胞上的增殖特性以及相关炎性因子的表达进行分析。TCID50结果表明在32h～36h病毒处于增殖的*高峰，且感染后28h～36h病毒增殖速度*快。IFA结果显示感染后8h就能检测到绿色荧光，随着感染时间的逐渐延长，出现荧光的细胞数量逐渐增多，至感染后36h～48h荧光强度达到*强，荧光定量PCR结果与IFA结果表明PHEV能在J774A.1细胞上复制增殖。荧光定量PCR结果显示PHEV感染J774A.1细胞后IL-6、TNF-a、IL-1β表达量提高，而IFN-β表达量则降低，PHEV在感染J774A.1细胞的过程中通过抑制IFN-β的表达而逃避机体**反应。本实验又从PHEV感染小鼠模型中提取大脑RNA特异性扩增出IFN-β基因，利用带有GST标签的pGEX-4T-1原核表达载体构建重组质粒，并且成功建立了pGEX-4T-1-IFN-β融合蛋白的原核表达系统，实现了在大肠杆菌内重组蛋白IFN-β的可溶性表达，经过Western-blot和SDS-PAGE分析鉴定，成功得到了有活性的重组蛋白，为深入研究PHEV逃避机体的**反应致病机制奠定了基础。为了进一步探究IFN-β在细胞模型和动物模型中是否参与抗病毒**。首先成功构建IFN-β实验组和正常接毒组的细胞感染模型，分别收集12h、24h、32h、48h、60h不同时间2组样品，利用IFA和荧光定量PCR研究PHEV复制增殖情况；然后在动物感染模型中，将有活性的IFN-β注射小鼠大脑，之后将PHEV-67N病毒液滴鼻接种于2组小鼠体内，分别采集感染后不同时间2组脑组织样本用于病理组织学观察和荧光定量PCR检测。在体内感染小鼠脑组织和体外感染J774A.1细胞荧光定量PCR结果显示，与正常接毒组相比，IFN-β实验组能够显著抑制PHEV的复制增殖。通过观察PHEV感染小鼠大脑的临床状态和病理组织学发现，在不同时间段正常接毒组均比IFN-β实验组出现大量血管套、噬神经现象和神经元坏死等更严重的病理变化，而IFN-β实验组在初期无显著的病理变化并在后期只出现部分淤血和小部分神经元变性坏死的现象。这些结果显示重组IFN-β可以有效的抑制HEV的复制，IFN-β在PHEV感染早期有一定的抗病毒效果，在一定程度上有保护小鼠大脑皮质免受PHEV的侵袭的作用。说明了IFN-β有抗HEV逃避天然**系统监视的作用。以上结果为研究PEVE**逃避机制奠定了理论基础，也提示我们可以将基因工程技术应用于IFN-β对PHEV**的预防和**。 还原 关键词：猪血凝性脑脊髓炎病毒; 巨噬细胞; 干扰素β; 导师：高丰; 分类号：S855.3
文内图片：
PHEV感染J774A.1细胞后CPE观察Figure1.1theCPEobservationofJ774A.1cellsinfectedwithPHEV
PHEV在J774A.1细胞中的一步生长曲线
J774A.1细胞接种PHEV后不同时间IFA检测Figure1.3theresultsofIFAwithJ774A.1cellsinfectedbyPHEVatdifferenttimesEFG
PHEV在J774A.1细胞中的增殖规律
IL-6、TNF-a、IL-1β、IFN-β的相对表达含量
IFN-β目的基因的PCR产物凝胶电泳图谱
重组质粒PCR鉴定Fig2.2theamplifieationofcloningplasmiddetectedbyPCR
重组质粒的酶切鉴定Fig2