王亚琦
中南大学
摘要：**(asthma)是以AHR、上皮结构性损伤、气道慢性炎症等为临床表型和病理特征的呼吸系统常见**,表现为呼吸道对一般性理化刺激或**、内源性**或炎症介质等过度反应,对病原微生物及毒性气体的抵抗力降低,易发生气道阻力增高和反复,**的发病机制目前仍不清楚,公认的有**反应失平衡和过敏原学说、神经源性气道炎症理论及气道上皮缺陷等。早期的研究显示,**病人气道上皮的病理改变与**的局部**炎症反应,气道重构及糖皮质**的**效果等密切相关。欧洲呼吸病杂志(Journal of European Respiration)多次明确将**归类于一类气道上皮性**。《全球支气管**防治倡议》(Global Initiative for Asthma,GINA)明确指出,支气管上皮功能**在**发病机理中的作用和Ig E介导的机制同等重要,应予关住。本室前期研究应用基因芯片筛选了人外周血白细胞差异表达的粘附分子,发现integrin04在**病人中表达下调。Toll样受体1是单个的跨膜非催化蛋白,是天然**与获得性**的桥梁,参与急性炎症与信号转导,TLRs可以识别多种微生物源的分子,即病原体相关分子模式,通过诱导编码细胞因子基因,如TNF-α和IFN-β转录而激活炎症。其中,TLR4具有普遍适用性。本课题组前期实验证明了integrin β4在**病人的气道粘膜表达降低,同时发现沉默integrin β4影响了HBECs的抗原提呈过程,使得上皮细胞激活Thl通路受到抑制。我们猜想integrin β4沉默可能影响Toll样受体在气道上皮的表达,从而进一步与气道局部的**失平衡密切相关。因此,本课题将主要研究integrin β4沉默对HBECs中TLR4表达及TLR4下游两条重要信号通路的影响。目的：观察integrin β4沉默对HBECs中TLR4表达的影响,及TLR4下游两条重要信号通路的影响。同时,研究integrin β4对诱导**细胞分化的作用,以及由此引起**失平衡,从而对引起**发病的**学理论进行初步的探讨。方法：(1)设计并合成integrin β4siRNA,并将其瞬时转染入HBECs中。通过荧光显微镜观察siRNA的转染效率,RT-PCR和流式细胞术分别从RNA和蛋白水平检测integrin β4的表达。(2)MTT法确定LPS的*佳给药浓度。(3)流式细胞术检测,在LPS作用下,正常HBECs组,Control siRNA组,integrin β4siRNA组TLR4的改变。(4) Western blot法检测,在LPS作用下,正常HBECs组,Control siRNA组,integrin β4siRNA组MyD88, TRIF的改变,反映integrin β4分别对TLR4下游分子的影响。(5)ELISA法检测,在LPS分别作用24h,48h,72h后,正常HBECs组,Control siRNA组,integrin β4siRNA组中TNF-α, IFN-β的改变,进一步检测integrin β4分别对TLR4两条信号通路的影响。(6)正常HBECs组,Control siRNA组,integrin β4siRNA组,分别受LPS刺激6h,与**细胞共培养72h,收集细胞上清液,ELISA法检测IFN-γ, IL-4,IL-17分泌量,观察integrin β4对诱导**细胞分化的影响。结果：(1)成功合成integrin β4siRNA,并转染]HBECs。荧光显微镜下观察,siRNA的转染效率为90%。与Control siRNA组相比,转染integrin β4siRNA的HBECs中,integrin β4在mRNA水平及蛋白水平表达均显著下降(2)LPS作用HBECs的*佳给药浓度为1μg/mL。(3)LPS刺激使得HBECs中TLR4的表达显著升高。与Control siRNA组相比,integrin β4siRNA组在LPS作用下,TLR4的表达升高更明显。(4)LPS刺激使HBECs中MyD88, TRIF的表达显著升高。与Control siRNA组相比,integrin β4siRNA组在LPS作用下,MyD88, TRIF的增加趋势更明显。(5)LPS刺激使HBECs中TNF-α和IFN-β的表达显著升高。与Control siRNA组相比,integrin β4siRNA组在LPS作用下,TNF-α和IFN-β的增加更明显。与**细胞共培养24h,48h,72h TNF-α的分泌量变化不明显,然而IFN-β的分泌量在24h,48h升高不明显,72h时明显增高。(6)较正常HBECs组和Control siRNA组相比,integrin β4siRNA组可以明显升高与之共培养的CD4+T细胞对IL-4,IL-17的分泌,对IFN-γ的分泌量无明显变化。在LPS作用下,LPS组较LPS阴性组相比,IFN-γ的分泌量明显升高,IL-4和IL-17的分泌量无明显差异。结论：(1)通过RNA干扰技术能有效沉默integrin β4,成功构建integrin β4细胞模型。(2)靶向沉默integrin β4可以明显促进TLR4的表达,激活TLR4下游两条信号通路,同时对MyD88依赖信号通路激活发24h,对MyD88非依赖信号通路激活发生在72h。(3)靶向沉默integrin β4促进CD4+T**细胞向Th2方向分化,平衡向Th2方向漂移,同时,诱导Th17型炎症发生。LPS在给药浓度为1μg/mL时,可以诱导Thl型**发生。
关键词：**; 支气管上皮细胞; 整合素β4; TOll样受体4;
导师：秦晓群; 刘持;
分类号：R562.25
荧光显微競观察integrinP4的转染效率
图I-z流式细胞术检测各组r}}c
RTPCR检洲瞬时转染siRNA的HBECs中斌
流式细胞术检测各组HBECs中integrinp4蛋白水平表达
流式细胞术检测各组HBECs中integrinP4蛋白水平的表达，ControlsiRNA组与正
流式细胞术检测LPS刺激后，integrinP4siRNA组较ControlsiRNA组TLR4增加更加明显，***尸<0.001VSControlSiRNA组，n=3，差异具有统计学意义.
Westernblotting检测LPS刺激对HBECs中MyD88表达的影响，与正常HBECs相比，LPS上调MyD88的表达量，*尸<0.05，n=3o
Westernblotting检测